Red基因重组技术简介
Red基因重组技术，能使外源同源线性DNA片段快速与基因组DNA相应基因同源重组，主要包括pKD46、pKD3、pCP20三个协助质粒。pKD46质粒由exo、beta、gam三个基因组成，它们分别编码Exo、Beta、Gam三种蛋白质，在一定浓度阿拉伯糖诱导下或诱导表达此三种蛋白。通过外源构建同源线性片段，导入受体菌，在这三种蛋白的协助下与受体菌基因发生同源重组，最终实现基因的突变和缺失。同时pKD46质粒是温度敏感型质粒，42°C条件下其会自动丢失。pKD3为克隆氯霉素抗性基因提供模板,与此同时在此质粒中，Cm两侧有FRT位点，该位点能够被FLP重组酶识别，当重组酶存在时会将此位点之，间的片段进行剪接，从而实现了Cm'去除，因此不仅为实验进行引入抗性标记，方便了重组菌的筛选，更重要的是此抗性标记会在因FRT位点的引入在需要时被酶切剔除。pCP20能够表达FLP重组酶，进而识别重组到基因组上的FRT位点，由此酶切掉两位点之间引入的抗性基因片段片段，最终实现目的基因的缺失。pCP20同为温敏型质粒，培养条件高于42°C时自动丢失。
与Red同源重组基因敲除相关的3个酶：
1、Exo蛋白：Exo蛋白是一种核酸外切酶，单亚基的分子量为24 kD，Exo蛋白的活性形式是一种环状三聚物分子，中间有一中空的通道，通道的一端可容纳双链DNA分子，另一端只可容纳单链DNA。Exo蛋白可结合在双链DNA的末端，从DNA双链的5’端向3’端降解DNA，使DNA分子形成3’粘性末端。
2、Beta蛋白：Beta蛋白在Red同源重组中起着决定性作用，具有介导互补单链DNA退火的功能，是一种退火蛋白，单亚基的分子量为25.8 kD。在溶液中，Beta蛋白自发地形成环状结构，紧紧地结合在单链DNA的3’突出端，防止DNA被单链核酸酶降解，并介导互补单链DNA的退火。双链DNA退火完成后，Beta蛋白从DNA双链上解离下来。
3、Gam蛋白：Gam蛋白为16kD的多肽分子，可与RecBCD核酸外切酶结合，抑制其对外源DNA的降解作用，防止外源DNA 进入细胞后被宿主降解。
实验步骤
1、制备pKD46/宿主菌电转感受态。
2、制备抗性基因打靶片段。
3、电转，筛选阳性克隆。
4、导入PCP20质粒消除抗性，无痕敲除。
相关质粒
pKD46:氨苄抗性，阿拉伯糖诱导表达Red系统重组酶
pKD46-Tet:四环素抗性，阿拉伯糖诱导表达Red系统重组酶
pKD20:氨苄抗性，阿拉伯糖诱导表达Red系统重组酶
pREDKI:卡那抗性，I-SceI,阿拉伯糖诱导表达Red系统重组酶
pKDsgRNA-ack:阿拉伯糖诱导表达Red系统重组酶，四环素诱导转录sgRNA
pREDCas9:携带针对氨苄基因的gRNA
pKD13:提供卡那霉素抗性重组模板
pKD4:提供卡那霉素抗性重组模板
pKD3:提供氯霉素抗性重组模板
pCP20:FLP重组酶消除抗性
参考文献
[1] Datsenko KA1, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA. 2000,97(12):6640-6645.
[2]Doublet B, Douard G, Targant H, et al. Antibiotic marker modifications of lambda Red and FLP helper plasmids, pKD46 and pCP20, for inactivation of chromosomal genes using PCR products in multidrug-resistant strains. J Microbiol Methods. 2008,75(2):359-361. Doi: 10.1016/j.mimet.2008.06.010