“同源重组””无缝克隆”常见问题及解决方案
2023-10-17
载体构建的技术方法有多种，如酶切连接法、同源重组（无缝克隆）、Gateway克隆等……以前，最常用的方法是“酶切酶连法”，即用限制性内切酶产生黏性末端，通过碱基互补配对，再用T4 DNA Ligase连接两个片段的克隆方法。近年来“同源重组技术”逐渐受到大家的欢迎。相比之下，同源重组技术操作更加简单，不受到酶切位点的限制，无需连接中间载体（直接实现一步目标载体构建），且可一次进行多个片段的拼接，大大提高了克隆效率，缩短了载体构建周期。
虽然同源重组技术操作简单，但实验过程环环相扣，有很多小细节都会影响最终的实验结果。今天，我们就带大家一起来Look Look……
A1.1 载体线性化不完全。
※ 产生原因：载体线性化不完全。
※ 判断方法：建议将已制备的线性化载体直接转化涂板。如果长克隆较多，则表示线性化不完全。建议优化酶切体系。A1.2 体系中混入了相同抗性的环状质粒。
※ 产生原因：
①以反向PCR方式进行载体线性化，残留环状质粒模板导致。
②目的基因PCR模板为与载体相同抗性的环状质粒，残留环状质粒模板导致。
※ 判断方法：将已制备的线性化载体和目的片段分别转化涂板，如果长克隆较多，则表示有相同抗性的环状质粒混入。建议PCR扩增产物先用Dpn I消化模板后，再进行胶回收纯化处理或直接进行胶回收纯化处理，去除残留的环状模板质粒。
A2.1 连接不成功。
1).引物设计错误。
※ 设计原则：同源臂（15-25 bp，GC含量40-60%）+酶切位点(根据实验需求保留或删除)+基因特异性引物。
2).载体与目标片段使用比例失调。
※ 载体与目的片段添加比例：推荐载体和外源插入片段的最佳摩尔比是n（载体）：n（插入片段）=1：2；推荐直接用片段长度来计算用量，无需算摩尔浓度，以4 kb长度的载体为例，使用量为20 ng/kb×4 kb=80 ng，低于2 kb的载体取最低使用量40 ng；以1 kb长度的插入片段为例，使用量为40 ng/kb×1 kb=40 ng，低于0.5 kb的外源插入片段取最低使用量20 ng。
3).载体与目的片段不纯。
※ 推荐对线性化载体、PCR产物进行胶回收纯化。若为未纯化的DNA，加入总体积不超过反应体系体积1/5。
4).操作问题或试剂盒失效。建议同时做阳性对照实验。
※ 判断方法：
①若阳性对照有克隆并检测为阳性，则排除试剂盒问题。
A2.2 连接成功但无克隆。
1).感受态细胞效率低。建议用转化效率＞107 cfu/μg的感受态细胞。
※ 判断方法：可转化0.1ng质粒（如PUC19），观察克隆数，若生长大于1000个菌斑，则转化效率大于107 cfu/μg。
2).抗生素种类选错或浓度不适当。
※ 建议将未线性化空载体转化涂板。判断方法：若未长克隆，则可能是抗性种类错误或浓度过高。需检查质粒图谱确认抗性或确认最适浓度。
A3.1 PCR失败。
1).PCR引物错误。
※ 建议用验证过的1对载体通用引物进行菌检，或至少使用一条通用引物。
2).破菌不到位。
※ 解决方法：
①提取质粒，以质粒做模板进行PCR验证；
A3.2 连接失败。
1).判断方法：目的片段上引物扩增无条带，或一端载体通用引物，另一端目的引物扩增无条带，但载体通用引物扩增有条带，且大小符合空载。
2).可能原因：载体线性化不完全。
A4.1 目的片段不纯，混有非特异PCR扩增产物。
1).可能情况。
※ PCR扩增目的基因时有非特异条带出现，未进行胶回收纯化。
2).解决方案。
①优化PCR体系，提高特异性；
②胶回收PCR产物；
A4.2 片段紊乱。
1).可能情况：载体或片段有多个同源重复序列。
2).解决方案：借助网站或软件进行序列比对（如NCBI等）。A4.3 排查引物设计问题。
试剂盒中的阳性对照包含线性化的质粒载体和外源插入片段，带有Amp抗性，第一次进行转化实验时，建议同时使用阳性对照（具体使用方法请参考说明书）。A5.1 阳性对照和目的连接产物转化后克隆都很少。
1).重组反应温控不准确。
※ 水浴锅、培养箱等仪器温控准确度不够，推荐使用PCR仪控温。
2).转化步骤有问题。
※ 排查感受态效率低；转化体积不适当；平板抗性选错或浓度不当等问题。A5.2 阳性对照克隆数正常，目的连接产物转化后克隆却很少。
1).目的连接产物的连接步骤有问题。
※ 排查同源臂长度/GC含量不适当；载体和片段纯度低或浓度和投入量不适当等问题。
2).克隆基因表达产物对宿主菌有毒。
※ 建议选择低表达背景的启动子和使用低拷贝克隆载体。