目前，酵母双杂互作验证实验有多种方案，本公司根据多年经验，总结出一个较优的点板互作验证实验方案，分为三个步骤：共转化，阳性克隆鉴定（选做），互作检测，本方案还对常见互作验证结果进行了分析。按照本方法流程操作，在最大程度上节约时间，最快10 d可出实验结果。
注：本方案不适用大批量酵母双杂交实验，因为蛋白表达、自激活检测和毒性验证应该预先完成。
产品组成：
注：
1.本试剂盒可用于10对互作蛋白验证（质粒除外）。
2.注意每个成份的保存温度，感受态细胞务必-80℃保存。
3. 0.5L×3代表：3个包装，每个包装0.5L；5×1mL代表：1个包装，含5个1mL。
实验方法：
一、实验耗材和试剂
本试剂盒提供的产品以产品组成为准，部分试剂和耗材需要自备，也可以在本公司单独购买。
1. 灭菌的枪头（1000 μL、200 μL、10 μL）、涂布棒或玻璃珠，Φ90 mm培养皿，备用。
2. Carrier DNA在95-100 ℃水浴5 min，后快速冰浴，可再重复一次，备用。
3. 金担子素准备：取100 μL AbA（1mg/mL）于900 μL无水乙醇中稀释，充分混匀，即AbA浓度为100 μg/mL，4 ℃冰箱中备用（稀释10倍后使用有利于在培养基中混匀，建议按用量稀释）。
4. 普通平板制备：
将1条培养基倒入0.5 L去离子水中，无需调节pH值，高压灭菌（如，115 ℃灭菌20 min）。液体培养基4℃保存备用；固体培养基，按照20-25 mL/块倒平板（Φ90 mm），凝固后放入4 ℃冰箱保存。
5. 特殊平板制备：
SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp with Agar（X-α-gal）：将一条SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp with Agar培养基溶于500 mL去离子水，无需调节pH值，高压灭菌（如，115 ℃灭菌20 min），冷却至50 ℃左右，每25 mL固体培养基加入25-50μL X-α-gal母液，倒平板（25 mL/块，Φ90 mm），凝固后于4 ℃冰箱保存。
SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp with Agar（AbA +X-α-gal）：将一条SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp with Agar培养基溶于500 mL去离子水，无需调节pH值，高压灭菌（如，115 ℃灭菌20 min），冷却至50 ℃左右，每25 mL固体培养基加入25-50μL X-α-gal溶液（20mg/mL），金担子素（AbA）参考表1加入，倒平板（20 mL/块，Φ90 mm），凝固后于4 ℃冰箱保存。
二、菌株使用及保存
1. 挑取一环甘油保存的菌液（约10-50μL）于SD/-Leu/-Trp平板上划线，28 ℃培养3-5 d，培养出来的单菌落可直接用于互作验证实验。
2. 挑取单菌落于SD/-Leu/-Trp液体培养基中，28 ℃培养48 h，OD600应大于1，取1 mL菌液集菌，弃上清，加入0.2 mL 15%甘油，-80 ℃可长期保存。
三、实验方法
双杂实验方案较多，本公司根据多年经验，给出一个较优的点板互作验证实验方案，我们将蛋白表达，自激活检测，毒性验证放在互作检测之后（本方案不作分析）。我们假设载体构建已完成，分为三个步骤：共转化，阳性克隆鉴定（选做），互作检测，本方案还对常见互作验证结果进行了分析。
3.1 共转化
1. 取100 µL冰上融化的Y2HGold感受态细胞，依次加入预冷的质粒pGBKT7（2-5 µg，约5 μL），pGADT7（2-5 µg，约5 μL），Carrier DNA（95-100 ℃，5 min，快速冰浴，重复一次）10 µL，PEG/LiAc 500 µL并吸打几次混匀，30 ℃水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
2. 将管放42 ℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
3. 5000 rpm离心40 s弃上清，ddH2O 400 µL重悬，离心30 s弃上清。
4. ddH2O 50 µL重悬，涂布于SD/-Leu/-Trp平板，28 ℃培养48-96 h。
注：按表1，将各质粒转入酵母Y2HGold感受态细胞中，阳性和阴性对照菌株于SD/-Leu/-Trp平板划线活化。
表1 酵母转化反应
注：对照组1*和2*可以更好的体现实验组是否有互作。
3.2 阳性克隆鉴定（选做）
此步骤可以省略。详细步骤可参考SK2420酵母阳性克隆快速检测试剂盒，本试剂盒包含猎物AD引物，诱饵BD引物可根据实际情况设计。
3.3 互作检测
1. 每个样品挑取新鲜单克隆（2-3 mm）于1 mL ddH2O无菌水中重悬，OD600调至0.2（也可以用SD/-Leu/-Trp液体培养基培养至OD600=0.2）。
2. 用ddH2O依次稀释10倍，100倍，1000倍（即OD600=0.2、0.02、0.002、0.0002）。
3. 按照先实验组后对照组的顺序，分别点10 μL菌悬液于SD/-Leu/-Trp、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal平板（如已知自激活浓度，需加入AbA），28 ℃培养48-96 h。
图1. 梯度稀释点板
四、结果分析
4.1 互作/无互作
由图2可知，对照组Y2HGold（pGBKT7-53+pGADT7-T）和Y2HGold（pGBKT7-Lam+pGADT7-T）在SD-Leu/Trp板上长势相同；Y2HGold（pGBKT7-53+pGADT7-T）在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal板上显蓝色，且长势同SD/-Leu/-Trp板；而Y2HGold（pGBKT7-Lam+pGADT7-T）在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal板上不生长且不显色，所以，pGBKT7-53与pGADT7-T有互作，pGBKT7-Lam与pGADT7-T无互作。同理，pGBKT7-Bait1与pGADT7-Prey1有互作，pGBKT7-Bait1与pGADT7无互作（即pGBKT7-Bait1无自激活）。
4.2 Bait蛋白有自激活
Y2HGold（pGBKT7-Bait2+pGADT7-Prey2）和Y2HGold（pGBKT7-Bait2+pGADT7），在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal板上显蓝色，且长势同SD/-Leu/-Trp平板，所以pGBKT7-Bait2具有自激活。解决自激活：在SD-Leu/Trp/His/Ade/X-α-gal板中加入梯度浓度的(AbA），重做互作验证实验即可。（更多问题解答可参考http://coolaber.com/Column.asp?Model=Content_Detail&Column_ID=29596&C_ID=273086949）
4.3 Prey蛋白有毒性
在SD/-Leu/-Trp平板上Y2HGold（pGBKT7-Bait3+pGADT7-Prey3）长势明显弱于Y2HGold（pGBKT7-Bait3+pGADT7）但是在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal板上Y2HGold（pGBKT7-Bait3+pGADT7-Prey3）能够显蓝色（虽然长势弱），Y2HGold（pGBKT7-Bait3+pGADT7）不能生长或生长较弱，同样能够证明pGBKT7-Bait3与pGADT7-Prey3有互作，pGBKT7-Bait3与pGADT7无互作（即pGBKT7-Bait3无自激活）。
五、总结
目前，酵母双杂互作验证实验常使用Y2HGold-GAL4系统，此外还有AH109-GAL4、EGY48-LexA和ProQuest系统，我们更推荐第一个方案。Y2HGold有四个报告基因，不仅可以很好的抑制诱饵自激活，而且能大大降低酵母双杂假阳性的概率。本公司根据多年经验，给出的点板互作验证实验方案，不仅减少培养基的使用，还能清楚的展现出实验组是否发生互作。本方案分析了三种实验结果互作/无互作，蛋白有毒性，诱饵有自激活，更多的问题解答，可联系本公司。
Coolaber
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